Functional and timing implications of transient faults in critical systems

Embedded systems in critical domains, such as auto-motive, aviation, space domains, are often required to guarantee both functional and temporal correctness. Considering transient faults, fault analysis and mitigation approaches are implemented at various levels of the system design, in order to maintain the functional correctness. However, transient faults and their mitigation methods have a timing impact, which can affect the temporal correctness of the system. In this work, we expose the functional and the timing implications of transient faults for critical systems. More precisely, we initially highlight the timing effect of transient faults occurring in the combinational and sequential logic of a processor. Furthermore, we propose a full stack vulnerability analysis that drives the design of selective hardware-based mitigation for real-time applications. Last, we study the timing impact of software-based reliability mitigation methods applied in a COTS GPU, using a fault tolerant middleware.This work has been partially funded by ANR-FASY (ANR-21-CE25-0008-01) and received funding by ESA through the 4000136514/21/NL/GLC/my co-funded PhD activity ”Mixed Software/Hardware-based Fault-tolerance Techniques for Complex COTS System-on-Chip in Radiation Environments” and the GPU4S (GPU for Space) project. Moreover, it was partially supported by the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness under grants PID2019-107255GB-C21 and IJC2020-045931-I (Spanish State Research Agency / http://dx.doi.org/10.13039/501100011033), by the European Union’s Horizon 2020 grant agreement No 739551 (KIOS CoE) and from the Government of the Republic of Cyprus through the Cyprus Deputy Ministry of Research, Innovation and Digital Policy.Peer ReviewedPostprint (author's final draft

SafeDrones: Real-Time Reliability Evaluation of UAVs using Executable Digital Dependable Identities

The use of Unmanned Arial Vehicles (UAVs) offers many advantages across a variety of applications. However, safety assurance is a key barrier to widespread usage, especially given the unpredictable operational and environmental factors experienced by UAVs, which are hard to capture solely at design-time. This paper proposes a new reliability modeling approach called SafeDrones to help address this issue by enabling runtime reliability and risk assessment of UAVs. It is a prototype instantiation of the Executable Digital Dependable Identity (EDDI) concept, which aims to create a model-based solution for real-time, data-driven dependability assurance for multi-robot systems. By providing real-time reliability estimates, SafeDrones allows UAVs to update their missions accordingly in an adaptive manner

The effect of atmospheric acidity on the solubility of metals and nutrients in atmospheric aerosols: observations and theoretical calcultions

The aim of this study is to investigate the role of air masses and their sources in the quality of air in the Eastern Mediterranean Area and more specifically in Finokalia, Crete. The study focuses on the effect of atmospheric acidity on the solubility of metals and nutrients in atmospheric aerosols and on the chemical processes between natural (dust) and man-made emissions in the atmosphere, in order to assess their impact on atmospheric deposition in the oceans. To achieve this, atmospheric aerosols and dust samples were collected. Aerosols’ sampling was carried out in Finokalia, Crete, where the Environmental Measurement Station of Environmental and Chemical Processes Laboratory (ECPL) is operating. Particles of two sizes were taken. In the main sampling, PM10 suspended particles were collected on quartz and teflon filters, from October 2012 to March 2015. Also, PM1 suspended particles were collected on quartz filters from October 2012 to November 2013. PM10 samples were analyzed for ionic and metals composition using ion chromatography and inductively coupled plasma (ICP-OES) spectroscopy, respectively. At the same time, the determination of soluble forms of nutrients (Fe and P) was carried out, in order to study the contribution of various natural and man-made sources, to their atmospheric deposition and consequently to their bioavailability in the marine ecosystem. The results of the present work were compared with the results obtained from the subsidiary sampling that took place in Corsica, France. Factor Analysis was applied to our results for the confirmation of the emission sources. Moreover, the ionic composition of PM1 particles was determined with the use of ion chromatography. The water content and the acidity of particles were also calculated. The sampling of dust took place in Heraklion, Crete, at an altitude of 20m for 11 months (October 2012 - November 2013). The dust samples were analyzed for ionic and metal composition. They were further processed appropriately and assessed for soluble forms of Fe and P at different acidity values. The results of the solubility experiments were used to explain the chemical aging of dust in the atmosphere and how it affects the solubility of its components. A key factor for better understanding the processes and parameters affecting the concentrations and the solubility of nutrients in atmospheric deposition in the Eastern Mediterranean was the investigation of the effect of air masses and their source of origin as calculated by the NOAA Hysplit Model (Hybrid Single - Particle Langrangian Integrated Trajectory), in parallel with the determination of the acidity of aerosols using the thermodynamic model ISORROPIA II.Στόχος της παρούσας μελέτης είναι η διερεύνηση του ρόλου των αερίων μαζών και των πηγών προέλευσής τους, στην ποιότητα του ατμοσφαιρικού αέρα της ανατολικής Μεσογείου, και πιο συγκεκριμένα του Φινοκαλιά της Κρήτης. Η μελέτη επικεντρώνεται στην επίδραση της οξύτητας της ατμόσφαιρας στη διαλυτότητα μετάλλων και θρεπτικών στα ατμοσφαιρικά αερολύματα και στις χημικές διεργασίες μεταξύ των φυσικών (σκόνη) και των ανθρωπογενών εκπομπών στην ατμόσφαιρα με σκοπό την εκτίμηση των επιπτώσεων τους στην ατμοσφαιρική εναπόθεση στους ωκεανούς. Για την επίτευξη του στόχου αυτού πραγματοποιήθηκαν δειγματοληψίες αιωρούμενων σωματιδίων και ξηρής εναπόθεσης σκόνης. Οι δειγματοληψίες των αιωρούμενων σωματιδίων πραγματοποιήθηκαν στο Φινοκαλιά της Κρήτης, όπου λειτουργεί ο περιβαλλοντικός σταθμός μετρήσεων του ΕΠΕΧΗΔΙ, και περιελάμβαναν τη δειγματοληψία δύο μεγεθών σωματιδίων. Η πρώτη και κύρια σειρά δειγματοληψιών αφορούσε αιωρούμενα σωματίδια ΡΜ10, τα οποία συλλέχθησαν σε φίλτρα χαλαζία (quartz) και τεφλόν, κατά την περίοδο από τον Οκτώβριο του 2012 μέχρι και το Μάρτιο του 2015. Η δεύτερη δειγματοληψία αφορούσε σωματίδια ΡΜ1, τα οποία συλλέχθηκαν σε φίλτρα χαλαζία κατά την περίοδο από τον Οκτώβριο του 2012 μέχρι και το Νοέμβριο του 2013. Στα δείγματα ΡΜ10 προσδιορίστηκε η χημική σύσταση ιόντων και μετάλλων με τη χρήση της ιοντικής χρωματογραφίας και της φασματομετρία οπτικής εκπομπής επαγωγικά συζευγμένου πλάσματος (ICP-OES), αντίστοιχα. Ταυτόχρονα, πραγματοποιήθηκαν αναλύσεις προσδιορισμού της διαλυτής μορφής των θρεπτικών (Fe και P) ώστε να μελετηθεί η συμμετοχή διαφόρων πηγών, φυσικών και ανθρωπογενών, στην ατμοσφαιρική εναπόθεσή τους και κατ’ επέκταση στη βιοδιαθεσιμότητά τους στο θαλάσσιο οικοσύστημα. Τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης συγκρίθηκαν με τα αποτελέσματα που προέκυψαν από την επικουρική δειγματοληψία που πραγματοποιήθηκε στην Κορσική της Γαλλίας, ενώ εφαρμόστηκε η ανάλυση παραγόντων (Factor Analysis) στα αποτέλεσματά μας, για τη διακρίβωση των πηγών εκπομπής. Στα δείγματα ΡΜ1, προσδιορίστηκε η ιοντική σύσταση με τη χρήση της ιοντικής χρωματογραφίας και υπολογίστηκε η περιεκτικότητα σε νερό των σωματιδίων καθώς και η οξύτητά τους. Η δειγματοληψία της ξηρής εναπόθεσης σκόνης πραγματοποιήθηκε στο Ηράκλειο Κρήτης, σε υψόμετρο 20m και σε διάστημα 11 μηνών (Οκτώβριος 2012 – Νοέμβριος 2013). Τα δείγματα σκόνης προσδιορίστηκαν ως προς την περιεκτικότητά τους σε ιόντα και μέταλλα. Επιπλέον επεξεργάστηκαν καταλλήλως και προσδιορίστηκαν οι διαλυτές μορφές Fe και Ρ, σε διαφορετικές τιμές οξύτητας. Τα αποτελέσματα των πειραμάτων διαλυτότητας χρησιμοποιήθηκαν με σκοπό την κατανόηση της «χημικής γήρανσης» της ερημικής σκόνης στην ατμόσφαιρα και πώς αυτή επηρεάζει τη διαλυτότητα των συστατικών της. Καθοριστικό ρόλο στην καλύτερη κατανόηση των διεργασιών και των παραγόντων που επηρεάζουν τις συγκεντρώσεις και τη διαλυτότητα των θρεπτικών στοιχείων στην ατμοσφαιρική εναπόθεση στην περιοχή της Ανατολικής Μεσογείου, αποτέλεσε η διερεύνηση του ρόλου των αερίων μαζών και της πηγής προέλευσής τους, όπως υπολογίστηκαν από το NOAA Hysplit Model (Hybrid Single – Particle Langrangian Integrated Trajectory) και ο προσδιορισμός της οξύτητας των αερολυμάτων με τη χρήση του θερμοδυναμικού μοντέλου ISORROPIA II

Development, optimization and validation of analytical methods for the determination of antiepileptic drugs in biological samples: application in Clinical and Forensic Toxicology

The aim of this thesis was the development, optimization and validation of gas chromatography-mass spectrometric methods for the simultaneous determination of antiepileptic drugs, in plasma and whole blood. During the method development, the necessity appeared for separation of the antiepileptics according to their chemical behavior. So, two methods were actually developed and validated, one for the determination of the nine alkaline antiepileptics (ethosuximide, carbamazepine, lacosamide, lamotrigine, levetiracetam, oxcarbazepine, phenobarbital, phenytoin and topiramate) and two metabolites (10,11-epoxide-carbamazepine and 10-hydroxy-carbazepine), and one for the antiepileptics with acidic (valproic acid and tiagabine) and zwitterionic (gabapentin, pregabalin and vigabatrin) behavior. The sample pretreatment included protein precipitation with acetonitrile, solid phase extraction and derivatization using MTBSTFA with 1% TBDMSCl at 70oC for 30min. Levetiracetam-d6 was used as internal standard for the determination of alkaline antiepileptics, whereas gabapentin-d10 was used for the acidic and zwitterionic antiepileptics. The validation of the methods included the evaluation of: selectivity, specificity and linearity, limits of detection and quantification, intra- and inter-day accuracy and precision, absolute recovery of the methods and the stability of analytes in spiked blood samples. The developed methods were applied for therapeutic antiepileptic drug monitoring and for the toxicological investigation of clinical and forensic cases.Ο σκοπός της διατριβής ήταν η ανάπτυξη, βελτιστοποίηση και επικύρωση μεθόδου ταυτόχρονου προσδιορισμού αντιεπιληπτικών φαρμάκων σε δείγματα πλάσματος και ολικού αίματος. Κατά την ανάπτυξη της μεθοδολογίας, προέκυψε η ανάγκη διαχωρισμού των υπό μελέτη φαρμάκων ανάλογα με τη χημική συμπεριφορά τους. Έτσι, αναπτύχθηκαν και επικυρώθηκαν δύο μέθοδοι, μία για τον προσδιορισμό των εννέα αλκαλικών αντιεπιληπτικών φαρμάκων (αιθοσουξιμίδη, καρβαμαζεπίνη, λακοσαμίδη, λαμοτριγίνη, λεβετιρακετάμη, οξυκαρβαζεπίνη, τοπιραμάτη, φαινοβαρβιτάλη και φαινυτοΐνη) και των δύο μεταβολιτών (10,11-εποξειδιο-καρβαμαζεπίνη, 10-υδροξυ-καρβαζεπίνη), και μία για τα φάρμακα με την όξινη (βαλπροϊκό οξύ και τιαγκαμπίνη) ή επαμφοτερίζουσα (βιγκαμπατρίνη, γκαμπαπεντίνη και πρεγκαμπαλίνη) συμπεριφορά. Η κατεργασία των βιολογικών δειγμάτων περιελάμβανε καταβύθιση πρωτεϊνών με ακετονιτρίλιο, εκχύλιση στερεής φάσης και παραγωγοποίηση χρησιμοποιώντας MTBSTFA με 1% TBDMSCl στους 70οC για 30 λεπτά. Στις μεθόδους χρησιμοποιήθηκε η λεβετιρακετάμη-d6 ως εσωτερικό πρότυπο για τον προσδιορισμό των αλκαλικών αντιεπιληπτικών και η γκαμπαπεντίνη-d10 για τον προσδιορισμό των όξινων και επαμφοτεριζόντων αντιεπιληπτικών. Οι παράμετροι επικύρωσης των μεθόδων ήταν: εκλεκτικότητα, ειδικότητα, γραμμικότητα, κατώτατο όριο ανίχνευσης και ποσοτικοποίησης, επαναληψιμότητα, ενδοεργαστηριακή αναπαραγωγιμότητα, ορθότητα εντός της ημέρας και δια των ημερών, απόλυτη ανάκτηση και ανθεκτικότητα των μεθόδων, καθώς και σταθερότητα των αναλυτών σε εμβολιασμένα δείγματα αίματος. Οι αναπτυχθείσες μέθοδοι εφαρμόστηκαν στην παρακολούθηση των θεραπευτικών επιπέδων αντιεπιληπτικών φαρμάκων και στην τοξικολογική διερεύνηση περιστατικών κλινικού και δικαστικού ενδιαφέροντος

Development and optimization of analytical methods for the determination of substitution substances in biological samples and their application in the therapeutic drug level monitoring in patients that follow maintance programs

Methadone (MDN) is used extensively for the maintenance of opioid addicts and it is the only treatment approved for opiate substitution during pregnancy and postpartum period, in Greece and in other countries. There are inter-individual differences in bioavailability and pharmacokinetic of MDN. Therapeutic monitoring of MDN and its metabolites (EDDP and EMDP) plasma levels is often necessary, in order to determine MDN dose and to obtain maximum treatment efficacy. Furthermore, MDN, EDDP and EMDP are excreted into breast milk, but there is no correlation between the MDN dose and breast milk MDN and its metabolites levels. Subsequently, the determination of MDN and its metabolites concentrations in breast milk is needed for the investigation of breastfeeding safety of newborns whose mothers are MDN maintained. The purpose of this study was to develop, optimize and validate gas chromatography-mass spectrometric methods for the determination of MDN, EDDP and EMDP in plasma and breast milk. Sample preparation included protein precipitation with acetonitrile and solid-phase extraction of the three analytes. MDN-d9 was used as internal standard for the determination of MDN and EMDP, while EDDP-d3 for EDDP. The following parameters were used to validate the GC/MS methods: selectivity, specificity, linearity, limit of detection (LOD), limit of quantification (LOQ), intra- / inter-day precision and accuracy, absolute recovery and robustness, as well as the stability of standards and spiked biological samples. The methods developed could be used for: a) therapeutic drug level monitoring in patients that follow MDN maintenance programs, b) determination of MDN and its metabolites in plasma samples obtained from arterial and venous umbilical cord blood in order to investigate MDN exposure of the fetus and c) determination of MDN and its metabolites concentrations in breast milk of MDN maintained mothers. Furthermore, the methods developed could find significant applications in Clinical and Forensic Toxicology, and provide useful data for critical decision making concerning acceptance of breastfeeding from MDN maintained mothers.Η μεθαδόνη (MDN) χρησιμοποιείται ευρέως στην θεραπεία υποκατάστασης εξαρτημένων από οπιοειδή ατόμων και αποτελεί την μόνη θεραπεία υποκατάστασης που επιτρέπεται κατά τη διάρκεια της εγκυμοσύνης και της επιλόχειας περιόδου, στην Ελλάδα και σε άλλες χώρες. Η φαρμακοκινητική και η βιοδιαθεσιμότητα της MDN ποικίλλουν από άτομο σε άτομο. Η παρακολούθηση των επιπέδων της MDN και των μεταβολιτών της (EDDP και EMDP) στο πλάσμα ασθενών που συμμετέχουν σε πρόγραμμα υποκατάστασης, είναι πολλές φορές αναγκαία προκειμένου να ρυθμιστεί το δοσολογικό σχήμα του ασθενή και η θεραπεία υποκατάστασης να είναι αποτελεσματική. Επίσης, η MDN, η EDDP και η EMDP απεκκρίνονται στο μητρικό γάλα, ενώ δεν υπάρχει καθορισμένη σχέση μεταξύ του δοσολογικού σχήματος MDN και των επιπέδων αυτής και των μεταβολιτών της στο μητρικό γάλα. Επομένως, ο προσδιορισμός των συγκεντρώσεων της MDN και των μεταβολιτών της στο μητρικό γάλα θεωρείται απαραίτητος για τη διερεύνηση της ασφάλειας του θηλασμού νεογνών που οι μητέρες τους συμμετέχουν σε πρόγραμμα υποκατάστασης με MDN. Σκοπός αυτής της Διδακτορικής Διατριβής ήταν η ανάπτυξη, βελτιστοποίηση και αξιολόγηση μεθόδων αεριοχρωματογραφίας σε συνδυασμό με φασματομετρία μαζών για τον προσδιορισμό της MDN, της EDDP και της EMDP, σε πλάσμα και μητρικό γάλα. Η κατεργασία των βιολογικών δειγμάτων περιελάμβανε καταβύθιση πρωτεϊνών με ακετονιτρίλιο και εκχύλιση στερεής φάσης. Στις μεθόδους χρησιμοποιήθηκε η MDN-d9 ως εσωτερικό πρότυπο για τον προσδιορισμό της MDN και της EMDP, ενώ η EDDP-d3 της EDDP. Οι παράμετροι αξιολόγησης των μεθόδων ήταν: εκλεκτικότητα, ειδικότητα, γραμμικότητα, κατώτατο όριο ανίχνευσης και ποσοτικοποίησης, επαναληψιμότητα, ενδοεργαστηριακή αναπαραγωγιμότητα, ορθότητα εντός της ημέρας και δια των ημερών, απόλυτη ανάκτηση και ανθεκτικότητα των μεθόδων, καθώς και σταθερότητα των αναλυτών σε πρότυπα διαλύματα και εμβολιασμένα βιολογικά δείγματα. Οι αναπτυχθείσες μέθοδοι μπορούν να βρουν εφαρμογή: α) στην παρακολούθηση των επιπέδων του φαρμάκου σε ασθενείς που συμμετέχουν σε πρόγραμμα υποκατάστασης με MDN, β) στον προσδιορισμό των συγκεντρώσεων MDN και μεταβολιτών της σε δείγματα πλάσματος που ελήφθησαν από το αρτηριακό και φλεβικό αίμα του ομφάλιου λώρου, προκειμένου να διερευνηθεί η έκθεση του εμβρύου σε MDN και γ) στον προσδιορισμό των συγκεντρώσεων της MDN και των μεταβολιτών της στο μητρικό γάλα γυναικών που συμμετέχουν σε πρόγραμμα υποκατάστασης. Παράλληλα, οι αναπτυχθείσες μέθοδοι μπορούν να βρουν εφαρμογή στην αντιμετώπιση διαγνωστικών προβλημάτων στο πλαίσιο της Κλινικής και Δικαστικής Τοξικολογίας, και να παρέχουν χρήσιμες πληροφορίες για την αποδοχή ή μη του θηλασμού νεογνών που οι μητέρες τους συμμετέχουν σε πρόγραμμα υποκατάστασης με MDN

Καρδιακή αμυλοείδωση ελαφριών αλυσίδων: Διερεύνηση του υποκείμενου μηχανισμού καρδιοτοξικότητας για την αποκάλυψη νέων στόχων καρδιοπροστασίας

Εισαγωγή: Ο όρος αμυλοείδωση περιλαμβάνει ένα ευρύ φάσμα ασθενειών που χαρακτηρίζονται από λανθασμένη αναδίπλωση πρωτεϊνών και την εναπόθεση ινιδίων αμυλοειδούς σε διάφορους ιστούς. Η αμυλοείδωση ελαφριών αλυσίδων (AL) είναι μία πλασματοκυτταρική δυσκρασία στην οποία κλωνικά πλασματοκύτταρα υπερπαράγουν ελαφριές αλυσίδες ανοσοσφαιρίνης που σχηματίζουν το αμυλοειδές και η καρδιακή συμμετοχή της νόσου σχετίζεται με μειωμένη επιβίωση. Η θεραπεία της AL αμυλοείδωσης στηρίζεται σε χημιοθεραπευτικές προσεγγίσεις που στοχεύουν στην εξάλειψη του πλασματοκυτταρικού κλώνου. Η πρόγνωση της AL βασίζεται στην αξιολόγηση καρδιακών δεικτών όπως τα νατριουρητικά πεπτίδια ή η τροπονίνη ακόμη και αν το αμυλοειδές δεν εντοπίζεται στον καρδιακό ιστό, ωστόσο μέχρι σήμερα δεν υπάρχουν συγκεκριμένες θεραπείες που να στοχεύουν στην μείωση της μυοκαρδιακής βλάβης. Μάλιστα, οι συνήθεις θεραπείες για την καρδιακή ανεπάρκεια είναι αναποτελεσματικές ή μη ανεκτές στην AL με καρδιακή συμμετοχή. Η πολυπλοκότητα στην AL στηρίζεται στο γεγονός ότι αφενός το αμυλοειδές διαταράσσει την αρχιτεκτονική του ιστού και παράλληλα, οι κυκλοφορούσες ελαφριές αλυσίδες επάγουν καρδιοτοξικότητα. Σήμερα, οι υποκείμενοι μηχανισμοί τοξικότητας δεν έχουν αποσαφηνιστεί και συνεπώς δεν έχουμε καταλήξει σε πιθανούς στόχους καρδιοπροστασίας για την ανάπτυξη νέων φαρμακομορίων και τη βελτίωση της λειτουργίας της καρδιάς. Σκοπός: Στόχος της διατριβής είναι η σύγκριση της καρδιοτοξικότητας των ελαφριών αλυσίδων που προέρχονται από ασθενείς με AL αμυλοείδωση και καρδιακή συμμετοχή σε σχέση με άλλες πλασματοκυτταρικές δυσκρασίες όπως το πολλαπλούν μυέλωμα (ΜΜ) και η μονοκλωνική γαμμαπάθεια αδιευκρίνιστης σημασίας (MGUS) χωρίς καρδιακές επιπλοκές, ώστε να βελτιώσουμε την κατανόησή μας για τους μηχανισμούς της επαγόμενης καρδιακής βλάβης στην AL. Πιο συγκεκριμένα οι στόχοι της εργασίας είναι 1) η γονιδιακή αλληλούχηση και η βιοτεχνολογική παραγωγή ελαφριών αλυσίδων πλήρους μήκους από ασθενείς με AL και καρδιακή συμμετοχή, από ασθενείς MM, MGUS ή μη κλωνικών ελαφριών αλυσίδων από υγιείς εθελοντές (YE), 2) η διερεύνηση της πιθανής καρδιοτοξικότητας των ελαφριών αλυσίδων σε τρείς διακριτούς κυτταρικούς πληθυσμούς, 3) η διερεύνηση των μηχανισμών τοξικότητας τόσο σε κλινικά δείγματα όσο και in vitro 4) η δημιουργία ενός in vivo μοντέλου καρδιοτοξικότητας από αμυλοειδογόνες ελαφριές αλυσίδες και 5) η δημιουργία ενός μοντέλου με αμυλοείδωμα AL κατάλληλο για τη μελέτη φαρμακομορίων που στοχεύουν στο αμυλοειδές. Μέθοδοι: Πλασματοκύτταρα CD138+ απομονώθηκαν από τον μυελό των οστών από ασθενείς με AL και καρδιακή συμμετοχή (n=8), με ΜΜ (n=2) και με MGUS (n=2) και μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος απομονώθηκαν από ΥΕ (n=2) για απομόνωση RNA και χαρακτηρισμό του ρεπερτορίου της οικογένειας των γονιδίων των ελαφριών αλυσίδων. Τα γονίδια που κωδικοποιούν τις κλωνικές ελαφριές αλυσίδες και τρείς ελαφριές αλυσίδες από ΥΕ, κλωνοποιήθηκαν και εκφράστηκαν σε κύτταρα Shuffle E.coli. Η αναδίπλωση των ελαφριών αλυσίδων, ο ολιγομερισμός και η τάση τους για τη δημιουργία αμυλοειδών αξιολογήθηκε μέσω φασματοσκοπίας κυκλικού διχρωϊσμού, ηλεκτροφόρησης και ηλεκτρονικής μικροσκοπίας αντίστοιχα. Πρωτογενή καρδιομυοκύτταρα μυών (pAVMCs), πρωτογενείς ινοβλάστες από το μυοκάρδιο και πρωτογενή λεία μυϊκά κύτταρα από αορτή εκτέθηκαν σε διάφορες συγκεντρώσεις ελαφριών αλυσίδων για την αξιολόγηση του κυτταρικού θανάτου και τη διερεύνηση των μηχανισμών καρδιοτοξικότητας. Παράλληλα, προσδιορίστηκαν δείκτες στο πλάσμα ασθενών με AL και πραγματοποιήθηκε πρωτεωμική ανάλυση λίπους ώστε να αναδειχθούν πιθανοί βιοδείκτες και μοριακοί μηχανισμοί που σχετίζονται με τη βλάβη. Για τη δημιουργία ενός in vivo μοντέλου καρδιοτοξικότητας από ελαφριές αλυσίδες, C57BL6 αρσενικοί μύες τυχαιοποιήθηκαν σε 6 ομάδες και υπεβλήθησαν σε ενδοκαρδιακή χορήγηση των τριών καρδιοτοξικών και αμυλοειδογόνων ελαφριών αλυσίδων, των ισοτυπικών ελαφριών αλυσίδων από ΥΕ είτε του διαλύτη. Ακολούθησε υπερηχογραφική αξιολόγηση της καρδιακής λειτουργίας, ιστολογική αξιολόγηση της βλάβης και μελέτη του επαγόμενου μηχανισμού τοξικότητας. Mύες Balb/c τυχαιοποιήθηκαν και ενέθηκαν υποδορίως με διαλύματα πλούσια σε αμυλοειδή που είχαν παρασκευαστεί από αμυλοειδογόνα πεπτίδια ή από ελαφριές αλυσίδες πλήρους μήκους των ασθενών για τη δημιουργία του μοντέλου με AL αμυλοείδωμα. Τρία μόρια που είναι επίπεδα, λιπόφιλα και έχουν την ικανότητα να προσδένονται σε αμυλοειδείς εναποθέσεις της νόσου Alzheimer’s χρησιμοποιήθηκαν ως υποψήφια ραδιοδιαγνωστικά για τον χαρακτηρισμό του μοντέλου με τη βοήθεια απεικόνισης τομογραφίας εκπομπής μονήρους φωτονίου (SPECT) και δοκιμών βιοκατανομής. Αποτελέσματα: Πραγματοποιήθηκε επιτυχημένη παραγωγή και απομόνωση 7 ελαφριών αλυσίδων πλήρους μήκους ασθενών με AL, 2 από MM, 2 από MGUS και 3 από YE. Όλες οι ελαφριές αλυσίδες είχαν ομοιότητα στη διαμόρφωση ως βήτα πτυχωτή επιφάνεια και στον ολιγομερισμό τους ως μείγμα μονομερών και διμερών. Τέσσερεις ελαφριές αλυσίδες που προέρχονται από τους ασθενείς με AL και καρδιακή συμμετοχή οδήγησαν σε καρδιοτοξικότητα στα pAVMCs που συσχετίστηκε με την ιδιότητα αυτών να σχηματίζουν αμυλοειδή και τρείς από αυτές εμφάνισαν τοξικότητα και στα λεία μυϊκά κύτταρα. Οι ελαφριές αλυσίδες προερχόμενες από YE, MM και MGUS δεν εμφάνισαν κυτταροτοξικότητα. Η πρωτεωμική ανάλυση στα δείγματα αναρροφήματος λίπους των ασθενών με AL αμυλοείδωση ανέδειξε ως σημαντικές σηματοδοτικές οδούς αυτές που σχετίζονται με το ενδοπλασματικό δίκτυο (ER) και τη φλεγμονή. Αντίστοιχοι μηχανισμοί τοξικότητας εντοπίστηκαν και in vitro στα καρδιομυοκύτταρα όπου η επώαση με τις αμυλοειδογόνες και τοξικές ελαφριές αλυσίδες αύξησαν τους δείκτες του ΕR στρες όπως οι πρωτεΐνες Bip και IRE-1a που στις κάπα ελαφριές αλυσίδες οδηγεί σε αυξημένη απόπτωση και στις λάμδα τύπου αλυσίδες σε αυξημένη αυτοφαγία. Οι κάπα ελαφριές αλυσίδες από ασθενείς με AL, MM και MGUS οδήγησαν σε αυξημένη φλεγμονή, υποδηλώνοντας ότι αυτός ο μηχανισμός είναι ανεξάρτητος από την παρατηρούμενη τοξικότητα. Στη κυκλοφορία των ασθενών με AL αμυλοείδωση εντοπίστηκε αύξηση της κυκλικής μονοφωσφορικής γουανοσίνης (cGMP) που συσχετίστηκε με αύξηση του δείκτη αντιδραστικής υπεραιµίας (flow-mediated dilatation-FMD). Η αύξηση αυτή ήταν σημαντική και στους ασθενείς που έχουν AL αμυλοείδωση με καρδιακή συμμετοχή και επίσης σχετίστηκε με τα επίπεδα απελευθέρωσης του cGMP από τα λεία μυϊκά κύτταρα. Οι κυτταροτοξικές ελαφριές αλυσίδες οδήγησαν σε αύξηση του ER στρες και στα λεία μυϊκά κύτταρα. Έτσι και στους δύο κυτταρικούς πληθυσμούς η χρήση του αναστολέα της IRE-1a απέτρεψε την κυτταροτοξικότητα επαγόμενη από τις ελαφριές αλυσίδες. Ιn vivo, η ενδοκαρδιακή χορήγηση των τριών κυτταροτοξικών και αμυλοειδογόνων ελαφριών αλυσίδων οδήγησε σε καρδιοτοξικότητα με εμφανείς ιστολογικές αλλοιώσεις. Η κάπα ελαφριά αλυσίδα εμφάνισε καρδιοτοξικότητα με χαρακτηριστικό φαινότυπο απόπτωσης των καρδιομυοκυττάρων και διατηρημένη συσταλτική λειτουργία ενώ οι λάμδα αλυσίδες οδήγησαν σε μειωμένο κλάσμα εξώθησης, διάμεση ίνωση και αυξημένη αυτοφαγία. Κοινός μηχανισμός τοξικότητας των χορηγούμενων ελαφριών αλυσίδων αναδείχθηκε η αύξηση των δεικτών ER στρες. Το μοντέλο αμυλοειδώματος AL που περιέχει αμυλοειδή από ελαφριές αλυσίδες πλήρους μήκους από ασθενείς με AL αμυλοείδωση βρέθηκε κατάλληλο για τον χαρακτηρισμό μορίων που προσδένονται σε αμυλοειδή και η χρήση του ανέδειξε ένα από τρία υποψήφια ραδιοδιαγνωστικά ως το καλύτερο για τον εντοπισμό αμυλοειδών AL in vivo. Συμπεράσματα: Οι ελαφριές αλυσίδες που προέρχονται από ασθενείς με AL αμυλοείδωση και καρδιακή συμμετοχή επάγουν καρδιοτοξικότητα, η οποία συσχετίζεται με το αμυλοειδογόνο δυναμικό τους και το ER στρες αποτελεί σημαντικό σηματοδοτικό μονοπάτι για την ανάπτυξη καρδιοπροστατευτικών παραγόντων. Η χρήση των ζωικών μοντέλων που αναπτύχθηκαν αναμένεται να συμβάλει στην ανάπτυξη καρδιοπροστατευτικών παραγόντων και φαρμακομορίων που στοχεύουν στο αμυλοειδές.Background and introduction: The term amyloidosis encompasses a wide spectrum of diseases characterized by protein misfolding and the deposition of amyloid fibrils in various tissues. Light chain amyloidosis (AL) is a plasma cell dyscrasia in which clonal plasma cells overproduce amyloid-forming immunoglobulin light chains, and cardiac involvement of the disease is associated with inferior survival. Treatment of AL amyloidosis relies on chemotherapeutic approaches aimed at eliminating the plasma cell clone. The prognosis of AL is based on the evaluation of cardiac markers such as natriuretic peptides or troponin levels even if the amyloid is not localized in the cardiac tissue, but to date there are no specific treatments aimed at reducing myocardial damage. In fact, standard treatments for heart failure are ineffective or intolerable in AL with cardiac involvement. The complexity in AL is based on the fact that on the one hand amyloid disrupts the tissue architecture and at the same time, the circulating light chains induce cardiotoxicity. Today, the underlying mechanisms of cardiotoxicity have not been elucidated and therefore we have not concluded on druggable targets for cardioprotection and improvement of the cardiac dysfunction. Purpose: The aim of the thesis is to compare the cardiotoxicity of light chains derived from patients with AL amyloidosis and cardiac involvement in relation to other plasma cell dyscrasias such as multiple myeloma (MM) and monoclonal gammopathy of undetermined significance (MGUS) without cardiac complications and to improve our understanding of the mechanisms of induced cardiac damage in AL. More specifically, the objectives are 1) gene sequencing and biotechnological production of full-length light chains from patients with AL and cardiac involvement, from MM, MGUS patients or non-clonal light chains from healthy volunteers (HV), 2) the investigation of the light chain induced cardiotoxicity in three distinct cell populations, 3) the investigation of toxicity mechanisms both in clinical samples and in vitro 4) the creation of an in vivo murine model of amyloidogenic light chain cardiotoxicity and 5) the establishment of an AL amyloid model suitable for the study of molecules targeting the amyloid. Methods: CD138+ clonal plasma cells were isolated from bone marrow from patients with AL and cardiac involvement (n=8), with MM (n=2) and with MGUS (n=2) and peripheral blood mononuclear cells were isolated from HV (n=2) to isolate RNA and characterize the light chain gene family repertoire. The genes encoding the clonal light chains and three light chains from HV were cloned and expressed in Shuffle E.coli cells. Light chain folding, oligomerization, and their propensity to form amyloids were assessed by circular dichroism spectroscopy, electrophoresis and electron microscopy, respectively. Primary adult murine ventricular cardiomyocytes (pAVMCs), primary fibroblasts from the myocardium and primary smooth muscle cells from aorta were exposed to various concentrations of light chains to assess cell death and investigate the mechanisms of cardiotoxicity. In parallel, circulating markers were determined in the plasma of AL patients and proteomic analysis on patient derive fat aspirates was performed to reveal potential biomarkers and molecular mechanisms associated with the tissue damage. To establish an in vivo light-chain induced cardiotoxicity model, C57BL6 male mice were randomized into 6 groups and subjected to intramyocardial administration of the three cardiotoxic and amyloidogenic light chains, the isotypic light chains from HV, or the vehicle. We characterized the model via echocardiography ultrasound evaluation of cardiac function, histological evaluation and we studied the mechanisms of the induced toxicity. Balb/c mice were randomized and injected subcutaneously with amyloid-rich solutions prepared from amyloidogenic peptides or full-length light chains of the patients to establish the AL amyloidoma model. Three molecules that are flat, lipophilic and can bind to Alzheimer's disease amyloid deposits were used as candidate radiodiagnostics to characterize the model using single photon emission tomography (SPECT) imaging and biodistribution assays. Results: We successfully produced and isolated 7 full-length light chains from AL patients, 2 from MM, 2 from MGUS and 3 from HV. All light chains were similar in conformation as a beta-sheets and in their oligomerization as a mixture of monomers and dimers. Four light chains derived from patients with AL and cardiac involvement led to cardiotoxicity in pAVMCs that was associated with their amyloid-forming property, and three of them also induced toxicity in vascular smooth muscle cells. Light chains derived from HV, MM and MGUS did not exhibit cytotoxicity. Proteomic analysis in adipose tissue of AL amyloidosis patients revealed that signaling pathways related to endoplasmic reticulum (ER) and inflammation are important. The corresponding toxicity mechanisms were also identified in vitro in pAVMCs since incubation with amyloidogenic and toxic light chains increased ER stress markers such as Bip and IRE-1a proteins which lead to increased apoptosis in kappa light chains and to increased autophagy in lambda type chains. Kappa light chains from AL, MM, and MGUS patients led to increased inflammation, suggesting that this mechanism is independent of the observed toxicity. In the circulation of patients with AL amyloidosis, an increase in cyclic guanosine monophosphate (cGMP) was detected, which was associated with an increase in the flow-mediated dilatation (FMD). This increase was also significant in patients who have AL amyloidosis with cardiac involvement and was also related to levels of cGMP release from vascular smooth muscle cells. The cytotoxic light chains led to an increase in ER stress in vascular smooth muscle cells as well. Thus, in both cell populations the use of the IRE-1a inhibitor prevented light chain-induced cytotoxicity. In vivo, intramyocardial administration of the three cytotoxic and amyloidogenic light chains resulted in cardiotoxicity with obvious histological alterations. The kappa light chain exhibited cardiotoxicity with a characteristic phenotype of cardiomyocyte apoptosis and preserved systolic function while the lambda chains led to reduced systolic function, interstitial fibrosis and increased autophagy. A common mechanism of toxicity of the administered light chains was shown to be the increase in ER stress markers. The AL amyloidoma model induced by full-length light chain amyloids from patients with AL amyloidosis was found suitable for the characterization of amyloid-binding molecules, and through its use we identified one of the three candidate radiodiagnostics as the best for detecting AL amyloids in vivo. Conclusions: Light chains deriving from patients with AL amyloidosis and cardiac involvement induce cardiotoxicity, which correlates with their amyloidogenic potential, and ER stress is an important pathway for the development of cardioprotective factors. We developed two animal models, and their use is expected to contribute to the development of cardioprotective agents and pharmacomolecules targeting the amyloid deposits

Μελέτη του ρόλου της κινάσης της συνθάσης του γλυκογόνου (GSK3β) στην καρδιοπροστασία μέσω φαρμακολογικής αναστολής

Εισαγωγή: Η κινάση της συνθετάσης του γλυκογόνου (GSK3β) έχει προταθεί ως ρυθμιστής του μιτοχονδριακού πόρου διαπερατότητας (mPTP) που θεωρείται τελικός στόχος της καρδιοπροστασίας. Ωστόσο, ο ρόλος της GSK3β στην ισχαιμία (Ι) και επαναιμάτωση (R) παραμένει αμφιλεγόμενος. Σκοπός: Σκοπός της παρούσας εργασίας είναι η διερεύνηση του ρόλου της GSK3β σε in vivo μοντέλο I/R, η συσχέτιση της φωσφορυλίωσής της με την καρδιοπροστασία και η μελέτη της αλληλεπίδρασης της GSK3β και του mPTP. Μέθοδοι: Πρωτόκολλο 1: Για την μελέτη της φαρμακολογικής αναστολής της GSK3β στην καρδιοπροστασία χρησιμοποιήθηκε ο γνωστός αναστολέας της κινάσης, η ΒΙΟ, και 5 δομικά ανάλογα αυτού (MLS2776-MLS2779). Συνολικά τριάντα επτά κόνικλοι υποβλήθηκαν σε 30’ I ακολουθούμενα από 3 ώρες R και τυχαιοποιήθηκαν σε 6 ομάδες. Στις πέντε ομάδες χορηγήθηκαν οι αναστολείς στην στοιχειομετρικώς ισοδύναμη καρδιοπροστατευτική δόση του μορίου ΒΙΟ στο 20ο λεπτό της I, ενώ στην έκτη ομάδα (Ομάδα ελέγχου) χορηγήθηκε φυσιολογικός ορός με Τween 80, που αποτελεί τον διαλύτη των μορίων. Στο τέλος της R προσδιορίστηκε το % ποσοστό της εμφραγματικής προς την ισχαιμική περιοχή (Ι/R ratio) ενώ σε δεύτερη σειρά πειραμάτων λήφθηκαν δείγματα ιστών για τον προσδιορισμό της pS9-GSK3β. Πρωτόκολλο 2: Αρσενικοί μύες C57BL/6 υποβλήθησαν σε 30’Ι/2 ώρες R και τυχαιοποιήθηκαν σε 3 ομάδες (n=9 ανά ομάδα): Ι) Ομάδα ελέγχου: Χορήγηση φυσιολογικού ορού με Τween 80, ΙΙ) Ομάδα MLS2776: Χορήγηση MLS2776 στα 31,6 mg/kg, ΙΙΙ) Ομάδα MLS2778: Χορήγηση MLS2778 στα 29,52 mg/kg. Η χορήγηση των μορίων πραγματοποιήθηκε στο 20ο λεπτό της I και στο τέλος της R προσδιορίστηκε το % Ι/R ratio. Σε δεύτερη σειρά πειραμάτων, λήφθηκαν δείγματα μυοκαρδιακού ιστού από την ισχαιμική ζώνη για τη διερεύνηση της αναστολής της GSK3β. Πρωτόκολλο 3: Αρσενικοί μύες C57BL/6 τυχαιοποιήθηκαν στις παρακάτω ομάδες I) Control (εικονικό χειρουργείο) και ΙΙ) I/R (30’ ισχαιμίας/10’ επαναιμάτωσης). Ακολούθησε λήψη μυοκαρδιακού ιστού, απομόνωση μιτοχονδρίων από την αριστερή κοιλία και προσδιορισμός της ικανότητας συγκράτησης Ca2+ (CRC) μετά από χορήγηση των εκλεκτικών αναστολέων ώστε να μελετηθεί η άμεση επίδρασή τους στον mPTP σε συνθήκες φυσιολογικής οξυγόνωσης και μετά από I/R . Το κυτοσολικό και μιτοχονδριακό κλάσμα αναλύθηκαν με Western Blot για τον εντοπισμό της GSK3β. Πρωτόκολλο 4: C57BL/6 μύες υποβλήθησαν σε 30’Ι/2 ώρες R και τυχαιοποιήθηκαν στις ομάδες Ι) Κυκλοσπορίνης (CsA) στην οποία η CsA χορηγήθηκε στα 10 mg/kg, ΙΙ) MLS2776 + CsA και ΙΙΙ) MLS2778 + CsA (n=7 ανά ομάδα) όπου η CsA συγχορηγήθηκε με τους αναστολείς στις προαναφερθείσες δόσεις για τον προσδιορισμό του %Ι/R ratio. Αποτελέσματα: Η χορήγηση των αναστολέων οδήγησε σε μείωση της έκτασης του εμφράγματος στους κονίκλους (9.1±3.1%, 26.8±2.9%, 10.2±1.9%, 28.5±4.0%, και 33.1±2.6%, αντίστοιχα, έναντι 49.5±3.9% της ομάδας ελέγχου, p<0.05). Αυξημένη pS9-GSK3β παρατηρήθηκε μόνο στις ομάδες MLS2776, MLS2777 και ΒΙΟ (p<0.05). Καρδιοπροστατευτική δράση από τα MLS2776 και MLS2778 παρατηρήθηκε και στους μύες (14,7 ± 1,4% και 15,4 ± 1,9% αντίστοιχα, έναντι 47,2 ± 2,8% για την ομάδα ελέγχου, p<0.001). Η μείωση της ενεργότητας της GSK3β επιβεβαιώθηκε στις δύο ομάδες των δύο αναστολέων από την μείωση της p(Y216)-GSK3β και της p(S33/37/T41)-β κατετίνης (p<0.05), αλλά όχι από την αύξηση της pS9-GSK3β. Παράλληλα, οι αναστολείς MLS2776 και MLS2778 είχαν επιπρόσθετο καρδιοπροστατευτικό αποτέλεσμα όταν συγχορηγήθηκαν με την CsA (10,23 ± 0,47% και 11,17 ± 0,76%, αντίστοιχα, έναντι 25,03 ± 1,03% για την ομάδα CsA, p <0,01), γεγονός που υποδεικνύει έναν παράλληλο μηχανισμό δράσης, ανεξάρτητο της αναστολής του mPTP μέσω CYPD. Tα μιτοχόνδρια I/R παρουσίασαν μειωμένη CRC σε σύκριση με τα control (p<0.05). Tα μόρια, ωστόσο δεν άλλαξαν την ανθεκτικότητα των μιτοχονδίων στην υπερφόρτωση με Ca2+ στις υπό μελέτη ομάδες αποκλείοντας άμεσες επιδράσεις στον mPTP. Επίσης, δεν παρατηρήθηκε μετανάστευση της GSK3β στα μιτοχόνδρια στο 10ο λεπτό της επαναιμάτωσης. Συμπεράσματα:. Η φαρμακολογική αναστολή της GSK3β μειώνει την ενεργότητα της κινάσης και επάγει καρδιοπροστασία με μηχανισμό επιπρόσθετο του αποκλεισμού των mPTP διαύλων. Ωστόσο, άμεση αλληλεπίδραση μεταξύ της κινάσης και του πόρου δεν παρατηρείται και απαιτείται περαιτέρω διερεύνηση των καθοδικών στόχων της GSK3β στον mPTPPurpose: The role of glycogen synthase kinase 3 beta(GSK3β) in cardioprotection and the link between GSK3β and the mitochondrial Permeability Transition Pore (mPTP) is debated. The purposes of this study were to I. Investigate the pharmacological inhibition and phosphorylation of GSK3β in cardioprotection II. Examine the direct effect of GSK-3β inhibitors on mPTP opening III. Define localization of the kinase on normoxic and ischemic heart Materials and methods: At first, we examined the established GSK3 inhibitor, BIO, and a series of novel selective analogues (MLS2776-MLS2779) using a rabbit model of 30’ ischemia (I) /3h reperfusion (R). The compounds were administered at the 20th min of I and infarct size (IS) was determined. GSK3β inhibitory phosphorylation (S9) was examined at the 10th min of R. Next, we elucidated the role of GSK3β using the best candidates. C57BL/6 mice underwent 30’ I /2hR and randomly received vehicle, MLS2776 or MLS2778 at the 20th min of I. IS was determined whereas myocardial tissue was obtained at the 10thminute of R to investigate GSK3β inhibition. Additionally, CsA(10mg/kg), MLS2776+CsA and MLS2778+CsA were administered for determination of IS. In order to address the GSK3β-mitochondria interaction, mice were either sham operated or subjected to 30’I/10’R and myocardial mitochondria were isolated, treated with the compounds and Calcium Retention Capacity (CRC) was estimated. GSK3β localization in the cytosolic and mitochondrial fractions was determined. Results: Rabbits treated with MLS series were protected compared to those treated with vehicle (10.6 ± 3.0%, 26.9 ± 2.9%,10.1 ± 1.5%,28.5 ± 4.0% vs 51.9 ± 2.5%, p<0.001). MLS2776 and MLS2778 reduced IS in mice (15.32±1.39% and 16.18± 1.91% vs 45.12±2.14%, p<0.05) and possessed an additional effect when co-administered with CsA indicating a different mechanism of action than CsA.(10.23±0.47%, 11.17±0.76% vs 25.03±1.03% for CsA p<0.05). GSK3β inhibition was confirmed by a decrease in p(Tyr216)-GSK3β and p(Ser33/37/Thr41)-βcatenin(p<0.05), but not by a p(S9)-GSK3β increase. CRC was not altered under normoxic and I/R conditions and GSK3β was primarily located in the cytosol. Conclusions: Pharmacological inhibition of GSK3β attenuates IS beyond mPTP inhibition. However, a direct interaction of GSK3β and mPTP cannot be established and GSK3β-mPTP axis should be further investigated